ThS. Đào Hữu Nghị - IVFMD Phú Nhuận, Bệnh viện Mỹ Đức Phú Nhuận
 
Protein phospholipase C zeta đặc hiệu của tinh trùng (PLCζ) được xem là tác nhân kích thích sinh lý chủ yếu để khởi động giải phóng Ca²⁺, chịu trách nhiệm kích hoạt noãn trong quá trình thụ tinh. Nhiều báo cáo về di truyền và lâm sàng trong mối liên hệ giữa các khiếm khuyết hoặc thiếu hụt yếu tố PLCζ có liên quan đến tình trạng thất bại hoạt hóa noãn (oocyte activation failure - OAF) đòi hỏi phải sử dụng biện pháp điều trị để khắc phục những trường hợp vô sinh do nam giới. Hiện nay, các trung tâm thụ tinh trong ống nghiệm điều trị các trường hợp OAF sau khi tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI) bằng Ca²⁺ionophore. Mặc dù Ca²⁺ ionophore được sử dụng thành công, nhưng đây là các tác nhân hóa học nên không thể kích hoạt mô hình dao động Ca²⁺ sinh lý. Hơn nữa, tính an toàn của Ca²⁺ ionophore này vẫn chưa được làm rõ. Do đó, việc sử dụng tác nhân nội sinh như PLCζ sẽ là biện pháp can thiệp lý tưởng để điều trị các trường hợp OAF. Trong bài viết này, nhóm nghiên cứu đã sản xuất ra một protein PLCζ tái tổ hợp của người gắn với protein liên kết maltose (maltose binding protein - MBP) và đánh giá hoạt động gây dao động Ca²⁺, các đặc điểm sinh lý học và tính ổn định theo thời gian của protein này. 
 
Vật liệu và phương pháp

• Biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp

Tế bào Escherichia coli được chuyển cấu trúc pETMM41-PLCζ và nuôi cấy cho đến khi mật độ quang học tại bước sóng 600 nm đạt 0,6. Sau đó, quá trình biểu hiện protein được kích thích trong 18 giờ bằng cách thêm 0,1 mM isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). Sau khi cảm ứng, các tế bào được thu hoạch bằng cách ly tâm và hòa lại trong dung dịch đệm ly giải cột amylose lạnh. Các tế bào đã được hòa lại được xử lý bằng sóng siêu âm bốn lần, mỗi lần 15 giây trên đá lạnh. Sau đó, ly tâm ở 4°C, các protein dung hợp có gắn thẻ MBP hòa tan được tinh sạch bằng sắc ký ái lực sử dụng cột nhựa amylose theo các quy trình tiêu chuẩn. Protein được rửa giải sau đó được thẩm tách trong dung dịch đệm phosphat và cô đặc lại.

• Vi tiêm protein tái tổ hợp vào noãn chuột

Noãn chuột được thu thập từ chuột cái CD1 siêu rụng noãn. Noãn được nuôi trong môi trường M2, tiêm vi lượng hỗn hợp 1:1 gồm 1 mM Oregon Green BAPTA dextran và protein tái tổ hợp MBP-PLCζ. Các tín hiệu huỳnh quang được ghi nhận từ noãn trong môi trường trên bàn gia nhiệt. Sự dao động Ca²⁺ bắt đầu ngay lập tức sau khi tiêm protein tái tổ hợp, các bản ghi dữ liệu sẽ bắt đầu từ thời điểm đó.

• Phân cực tròn lưỡng sắc (Circular dichroism - CD)

Các phép đo CD được thực hiện bằng cách sử dụng máy quang phổ. Protein PLCζ tái tổ hợp gắn thẻ MBP được hòa tan trong dung dịch đệm PBS và nồng độ được tính toán dựa trên độ hấp thụ tại 280 nm. Quang phổ CD vùng cực UV được thu thập trong khoảng bước sóng từ 260–180 nm với tốc độ quét 50 nm/phút, sử dụng nồng độ mẫu là 1,8 mg/mL để nghiên cứu cấu trúc bậc hai của MBP-PLCζ. Tổng cộng có 8 lần tích lũy được ghi lại và dữ liệu CD thô đã được trừ đi từ quang phổ của dung dịch đệm. Quang phổ của protein bị biến tính được thu ở 90°C. Dữ liệu biến đổi nhiệt được thu thập bằng cách đo sự thay đổi độ cực mol tại 222 nm trong khoảng nhiệt độ từ 20–90°C với tốc độ 1°C mỗi phút. Nhiệt độ nóng chảy được ước tính bằng phần mềm OriginPro.

• Kiểm tra hoạt tính của phospholipase C

Hoạt tính thủy phân PIP2 của MBP-PLCζ được phân tích, nồng độ PIP2 cuối cùng trong hỗn hợp phản ứng là 220 mM, chứa 0,05 mCi [3H]PIP2. Thử nghiệm thủy phân được đo tại các thời điểm khác nhau (0, 1, 7, 14, 30, 60, 90 ngày), trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau (4°C, −20°C và −80°C). Để kiểm tra sự phụ thuộc của hoạt động enzym phospholipase C (PLC) vào Ca²⁺, các đệm Ca²⁺ được chuẩn bị bằng cách trộn EGTA/CaCl₂. Các giá trị Km và EC50 về sự phụ thuộc vào Ca²⁺ cho quá trình thủy phân PIP2 của protein PLCζ tái tổ hợp gắn thẻ MBP được xác định bằng phân tích hồi quy phi tuyến.

• Nuôi cấy phôi gà và kiểm tra trong noãn

Trứng gà Leghorn trắng được thụ tinh được ủ trực tiếp ở nhiệt độ 37,5°C. Trứng được chia thành ba nhóm: Nhóm 1 (n = 55): "đối chứng dương" không tiêm; Nhóm 2 (n = 55): được tiêm 200 µL PBS vô trùng “đối chứng âm”; Nhóm 3 (n = 55): “điều trị”  tiêm 1 µg protein tái tổ hợp MBP-PLCζ được hòa trong PBS. Vào ngày phôi (ED) 0, bề mặt vỏ trứng được khử trùng bằng cồn 70% và khoan một lỗ nhỏ ở đầu cùn của trứng. Phôi được xử lý bằng cách tiêm vào lòng đỏ. Sau đó, lỗ được bịt kín bằng PVC. Trứng được soi hàng ngày để kiểm tra khả năng sống của phôi. Trứng không có phôi và phôi chết được lấy ra khỏi tủ và kiểm tra xem có bất thường không. Thí nghiệm kết thúc ở ED10. Trứng sống được đập vỡ và kiểm tra trực quan về sự hình thành mạch máu và các bất thường về phát triển. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Đường cong Kaplan–Meier được sử dụng để chỉ ra sự sống còn của nhóm được điều trị và nhóm đối chứng. GraphPad prism được sử dụng để ước tính ý nghĩa thống kê giữa các nhóm.
 
Kết quả

• Protein MBP-PLCζ tái tổ hợp của người có hoạt động gây dao động Ca²⁺

Những nỗ lực trước đây của nhóm nghiên cứu nhằm tạo ra phiên bản protein PLCζ của người tái tổ hợp không gắn thẻ hoặc chỉ gắn thẻ hexahistidine (6xHis) bằng cách sử dụng hệ thống biểu hiện vi khuẩn đã không thành công, tạo ra protein PLCζ không hòa tan và/hoặc không hoạt động. Tuy nhiên, trước đây nhóm nghiên cứu đã chứng minh rằng cả NusA và MBP đều là những thẻ hợp nhất cực kỳ hiệu quả đối với biểu hiện vi khuẩn protein PLCζ của con người, tạo điều kiện thuận lợi cho việc sản xuất protein PLCζ tái tổ hợp hòa tan và hoạt động. Hơn nữa, nhóm nghiên cứu đã báo cáo trước đây, các thí nghiệm so sánh với các thẻ NusA và MBP cho thấy MBP là đối tác hợp nhất protein hiệu quả hơn cho PLCζ.
Việc vi tiêm protein MBP-PLCζ tái tổ hợp của người vào noãn chuột ở nồng độ 0,05 mg/mL cho thấy nó có hoạt tính gây dao động Ca²⁺ mạnh, kích hoạt các dao động Ca²⁺ đặc biệt mô phỏng những dao động được quan sát thấy sau khi vi tiêm chiết xuất tinh trùng tự nhiên. Nồng độ protein PLCζ tái tổ hợp được chọn cho các thí nghiệm vi tiêm vào noãn chuột đã được sử dụng trong các nghiên cứu trước đây, sau một số thí nghiệm tối ưu hóa và cho thấy có hiệu quả trong việc gây ra dao động Ca²⁺ ở tất cả các noãn được tiêm. Hơn nữa, tất cả noãn được tiêm protein MBP-PLCζ tái tổ hợp của người đều hình thành thể cực thứ hai.

• Phổ CD và độ ổn định protein của protein tái tổ hợp MBP-PLCζ

Phổ CD vùng cực tím xa của protein MBP-PLCζ ở 25°C cho thấy cấu trúc protein được gấp nếp tốt. Phổ CD hiển thị hai giá trị cực tiểu đặc trưng ở 222 nm và 208 nm, cho thấy hàm lượng xoắn ốc cao đối với protein MBP-PLCζ. Việc làm nóng mẫu đến 90°C dẫn đến sự mở ra do nhiệt của protein, tạo thành cấu trúc giống như dạng cuộn ngẫu nhiên với đỉnh âm đặc trưng ở 200–205 nm. Tuy nhiên, một số thành phần cấu trúc thứ cấp vẫn được giữ lại trong cấu trúc cuối cùng, vì tín hiệu CD trong vùng 220–225 nm bằng khoảng 30% tín hiệu của protein ở 25°C.
Dữ liệu nhiệt độ nóng chảy của MBP-PLCζ, được theo dõi ở 222 nm, cho thấy những thay đổi ở cấp độ cấu trúc thứ cấp bắt đầu ở 55°C, trong khi nhiệt độ nóng chảy của quá trình chuyển đổi nhiệt là Tm = 60,3°C. Ở 70°C, quá trình chuyển đổi nhiệt hoàn toàn. Quá trình chuyển đổi nhiệt MBP-PLCζ không thể đảo ngược, vì không quan sát thấy sự thay đổi nào nữa trong quang phổ khi protein được làm lạnh trở lại 25°C và quan sát trực quan mẫu cho thấy sự hình thành các tập hợp lớn.

• Protein MBP-PLCζ tái tổ hợp của người vẫn giữ được đặc tính enzyme sau 90 ngày ở nhiệt độ −80 °C

Việc lưu trữ protein MBP-PLCζ trong thời gian dài ở 4°C và −20°C dẫn đến giảm đáng kể hoạt động enzyme. Cụ thể hơn, việc bảo quản ở nhiệt độ −20°C trong 90 ngày dẫn đến giảm đáng kể hoạt tính của MBP-PLCζ để thủy phân PIP2, trong khi bảo quản ở nhiệt độ 4°C trong 90 ngày dẫn đến mất gần như hoàn toàn hoạt tính enzyme. Để kiểm tra xem có sự thay đổi đáng kể nào về giá trị trung bình giữa các hoạt động của enzyme ở các điều kiện bảo quản khác nhau hay không, nhóm nghiên cứu đã thực hiện phân tích one-way ANOVA, sau đó là máy tính kiểm định Tukey. Kết quả cho thấy bảo quản ở nhiệt độ −80°C là nhiệt độ hiệu quả nhất để protein MBP-PLCζ tái tổ hợp duy trì hoạt động enzyme của nó trong số tất cả các nhóm được thử nghiệm. Hơn nữa, protein được lưu trữ ở nhiệt độ −80 °C vẫn giữ nguyên mọi đặc tính enzyme, bao gồm độ nhạy Ca²⁺ và hằng số Michaelis–Menten Km.

• Phơi nhiễm protein MBP-PLCζ tái tổ hợp không ảnh hưởng đến khả năng sống của phôi gà

Tác dụng của protein tái tổ hợp MBP-PLCζ đối với khả năng sống của phôi đã được nghiên cứu trong thời gian 7 ngày. Trứng được kiểm tra hàng ngày bằng cách soi để phân biệt phôi sống và phôi chết. Ở ED5, tỷ lệ sống sót của cả ba nhóm đều giảm nhẹ (khoảng 15–18%). Sự giảm tỷ lệ sống sót này có thể là do tính chất quan trọng của những ngày đầu phát triển phôi của gà. Như thể hiện trong đường cong sống sót Kaplan–Meier, tỷ lệ sống sót không khác nhau giữa ba nhóm cho đến thời điểm kết thúc nghiên cứu. Dữ liệu của nghiên cứu cho thấy việc tiếp xúc với 1 µg protein MBP-PLCζ tái tổ hợp của con người không ảnh hưởng đến khả năng sống của phôi gà.
 
Tóm lại, dữ liệu cho thấy tiềm năng sử dụng protein MBP-PLCζ tái tổ hợp của người như một công cụ điều trị cho các trường hợp vô sinh nam liên quan đến OAF. Tuy nhiên, cần có thêm các nghiên cứu để điều tra chi tiết hơn về khả năng ứng dụng của protein MBP-PLCζ trước khi sử dụng trong lâm sàng.
 
Nguồn: Saleh, A., Thanassoulas, A., Aliyev, E., Swann, K., Naija, A., Yalcin, H. C., ... & Nomikos, M. (2024). Development of Recombinant PLC-Zeta Protein as a Therapeutic Intervention for the Clinical Treatment of Oocyte Activation Failure. Biomedicines, 12(6), 1183.
Link bài báo:  https://www.mdpi.com/2227-9059/12/6/1183

Từ khóa: vô sinh nam, phospholipase C, PLC-zeta, tinh trùng, IVF, ICSI, thụ tinh, OAF